در این مطلب به طور اختصاصی به تشخیص آزمایشگاهی سل می‌پردازیم و در پایان هم تست توبرکولین را بررسی میکنیم. پیشتر در مقاله کاملی باکتری عامل سل یعنی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس را زیر ذره بین بردیم و مکانیسم ایجاد سل را بررسی کردیم که میتوانید در مقاله از بیماری زایی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس تا درمان سل بخوانید.
نمونه گیری اولین مرحله در تشخیص آزمایشگاهی سل است
اولین مرحله برای تشخیص آزمایشگاهی سل نمونه گیری است. این بدان معناست که ابتدا باید در مکان هایی که احتمال وجود مایکوباکتریوم توبرکلوزیس هست دنبال این باکتری بگردیم. بهترین نمونه ها برای تشخیص آزمایشگاهی سل عبارتند از:
- خلط
- شیره معده
- ادرار
- CSF
- Broncho Alveolar Lavage) BAL)
- در بچه هایی که قادر به ایجاد خلط نیستند از شیره معده استفاده می شود.
نمونه هایی چون خلط و مدفوع که حاوي فلور نرمالند باید آلودگی زدایی شده که تا حد ممکن باکتري هاي فلور حذف شوند. همچنین نمونه خلط نیاز به هموژن شدن نیز دارد. از محلول هایی از قبیل N-استیل L-سیستئین (هموژن)، سود ۲-۴% (آلودگی زایی) و… استفاده می گردد. از مخلوط این دو ماده نیز می توان استفاده کرد.
در تشخیص آزمایشگاهی سل پس از نمونه گیری و تهیه گسترش از نمونه ها میتوان بلافاصله از نمونه ها گشترش تهیه نمود و آن ها را به شکل مستقیم مورد ارزیابی قرار داد. گسترش ها را می توان با رنگ آمیزي فلورسانس با استفاده از اورامین- رودامین رنگ و زیر میکروسکوپ فلورسانس مشاهده نمود. مایکو باکتریوم ها داراي فلورسانس زرد خواهند بود (حساس تر از روش ذیل نلسون است ولی ذیل نلسون اختصاصی تر است). همچنین می توان از رنگ آمیزي ذیل – نلسون با فوشین بازي استفاده کرد. در این روش مایکو باکتریوم ها در برابر رنگ بري مقاومت کرده و به رنگ قرمز و سایر باکتري ها به رنگ آبی در خواهد آمد. این خاصیت اسید فست نام دارد و مایکوباکتریوم ها اسید فست مثبت هستند.
کشت مرحله دوم در تشخیص آزمایشگاهی سل است
مرحله بعد از نمونه گیری در تشخیص آزمایشگاهی سل کشت نمونه هاست. در کشت محیط برای باکتری فراهم میشود و اگر باکتری در آن نمونه وجود داشته باشد پس از کشت کلنی های باکتری در نمونه قابل ردیابی هستند. سه فرمولاسیون زیر براي محیط هاي کشت مایکو باکتریوم وجود دارد:
- محیط هاي کشت با پایه ي تخم مرغ سفت شده: رایج ترین این محیط ها “لوون اشتاین – جانسون ” است که حاوي زرده تخم مرغ، گلیسرول، پودر سیب زمینی و انواع نمک هاست. همچنین مالاشیت گرین هم به عنوان مهار کننده ي سایر باکتري ها به آن اضافه می گردد. کلونی هاي MTB به رنگ کرم-نخودي و فاقد پیگمان و چین دار ظاهر می گردند. در اکثرموارد کلونی ها در حدود ۱۰ روزبعد ظاهر می شوند و با اضافه کردن آنتی بیوتیک ها می توان آن را انتخابی کرد.
- محیط هاي با پایه آگار: مانند میدل بروك ۷H10 و ۷H11 که حاوي انواعی از نمک ها، ویتامین ها، آلبومین، کاتالاز، گلیسرول و مالاشیت گرین می باشند. محیط هاي آگار صناعی براي مشاهده شکل کلونی ها و آزمایش حساسیت باکتري ها با افزودن برخی آنتی بیوتیک ها به عنوان محیط انتخابی بکار می روند.
- محیط هاي براث: محیط هاي براث مثل ۷H12 و ۷H9 تکثیر نمونه هاي کوچک را میسر می کنند. نمونه ها باید در ۳۵-۳۷ درجه در حضور Co2 % 5-10براي ۸ هفته نگهداري شوند .
از نظر خصوصیات رشد مایکو باکتریوم ها هوازي اجباري هستند و افزایش Co2 باعث افزایش رشد آنها می شود. میانگین زمان دو برابر شدن آنهاحدود ۱۸ ساعت است و معمولاً پس از ۲۰ روز کلونی ها ظاهر می شوند که این مورد در مرحله دوم تشخیص آزمایشگاهی سل یک چالش محسوب میشود. اشکال ساپروفیتی سریعتر رشد می کنند در دماي ۲۲ درجه به خوبی رشد کرده رنگدانه بیشتري تولید می کنند و خاصیت اسید فاست کمتري نسبت به اشکال بیماریزا دارند.
سیستم هاي کشت سریع
رایجترین سیستم کشت سریع مایکوباکتریوم ها سیستم کشت Bactec است. در یک مدل آن که از محیط میدل بروك Bactec 460) 7H12) استفاده می شود که حاوي سوبستراي اسید پالمیتیک نشاندار است. مایکوباکتریوم ها پس از رشد در این محیط، از اسید پالمیتیک استفاده کرده و Co2 نشاندار آزاد کرده که توسط دستگاه خاصی به روش رادیومتریک سنجیده می شود. در مدل هاي جدیدتر یک ماده فلورسنت حساس به اکسیژن در ته ظرف محیط قرار داده می شود؛ زمانی که میزان اکسژن محیط کشت زیاد باشد ماده فلورسنت خاموش می باشد ولی در صورت حضور و رشد باکتري، اکسیژن محیط مصرف و کاهش یافته و فلورسنت ازاد می گردد که توسط دستگاه هاي اتوماتیک به روش فلورومتریک قابل ردیابی است.
مرحله سوم تشخیص آزمایشگاهی سل تایید وجود مایکوباکتریوم هاست
گونه هاي مختلف را پس از رشد باکتري ها می توان با انجام تست هاي افتراقی زیر تعیین هویت کرد:
- تولید نیاسین
- احیاء نیترات
- کاتالاز
- هیدرولیز توئین ۸۰
- پیرازین آمیداز
- محیط رشد درحضور TCH (تیوفن- کربوکسیلیک اسید هیدرازید)
- و …
براي مایکوباکتریوم توبرکلوزیس تست هاي رشد در محیط حاوي TCH، نیاسین، احیاء نیترات و پیرازین آمیداز مثبت و می تواند آن را از مایکو باکتریوم بوویس افتراق دهند و تست مهمی در تشخیص آزمایشگاهی سل به کار میروند.
نشانگرهاي مولکولی (پروب ها) روشی سریع ، حساس و اختصاصی براي تعیین هویت مایکوباکتریوم ها فراهم آورده اند. در این روش RNA ریبوزومی از باکتري استخراج می شود. در هر سلول نزدیک به ۱۰۰۰۰نسخه از rRNA وجود دارد که در مجاورت با پروب هاي نشاندار اختصاصی (DNAنشاندار) هیبرید DNA-RNA10 را بوجود می آورند. این پروب ها معمولا با مواد ” کمی لومینسانس ” نشاندار می شوند لذا می توان شدت نور را بر اساس میزان هیبریدها را اندازه گیري کرد.
استفاده از روش PCR جهت تشخیص ژن هاي اختصاصی روشی حساس واختصاصی است و زمان بسیار کمی نیاز دارد. حساسیت کلی آن % ۵۵-۹۰ و ویژگی %۹۹دارد.
آزمون آزاد سازي اینترفرون گاما (IGRAs): گاهی نتایج تست توبرکولین به خصوص در افراد واکسینه و یا ساکن در نواحی با شیوع بالاي مایکوباکتریوم هاي غیر توبرکلوزیس گمراه کننده و مبهم است. این تست ها بر اساس میزان آزاد سازي اینترفرون گاما در مواجه لنفوسیت هاي جدا شده از خون بیمار با آنتی ژن هاي اختصاصی ESAT-6) MTBو -CFP 10) پایه گذاري شده است. اگر شخص قبلا با Mtb برخورد کرده باشد لنفوسیت هاي Tحساس شده و در آزمایشگاه این سلول ها در مواجه با آنتی ژن هاي این باکتري میزان زیادي اینترفرون گاما تولید می کنند. تست هاي Quantiferon-gold و T-SPOT-TB از جمله این ازمایشات می باشند.
تست توبرکولین
یک آزمون با نام تست توبرکولین برای غربالگری وجود دارد که تست ارزان و قابل اعتمادی قبل از شروع تشخیص آزمایشگاهی سل است. این تست توسط مشتقات پروتئینی خالص شده توبرکولین (PPD1) انجام می گیرد. PPD یک فراورده نسبتاً خالص پروتئینی از توبرکولین کهنه (جوشانده کشت براث مایکوباکتریوم توبرکلوزیس) است که در مجاورت با سولفات آمونیوم تهیه می شود. فعالیت بیولوژیک PPD با ” واحد توبرکولین یا ” TU سنجیده می شود . توبرکولین درجه اول، ۱ TU بینابینی ۵ TU و درجه دوم ۲۵۰ TU میباشد.
براي غربالگري و بیماریابی از توبرکولین ۵ TU استفاده می شود. در افرادي که مشکوك به واکنش ازدیاد حساسیت به توبرکولین می باشند از دوز ۱TU شروع می گردد. از ۲۵۰TU زمانی که واکنش به ۵ TU منفی باشد استفاده می شود. میزان تزریق ۰/۱ PPD میلی لیتر و به شکل داخل پوستی (I.D) می باشد. چند ساعت پس از تزریق ممکن است واکنش در محل تزریق ایجاد گردد ولی نتیجه اصلی را باید بعد از ۴۸-۷۲ ساعت قرائت کرد که قطر تورم و سفتی (Induration) اندازه
گیري می گردد .
بعد از تزریق واکسن BCG ممکن است یک نتیجه مثبت براي ۳-۷ سال طول بکشد. تنها با ریشه کن شدن باسیل سل زنده تست منفی می گردد. نتایج منفی تست توبرکولین نشان می دهدکه :
- شخص تا به حال به مایکوباکتریوم توبرکلوزیس آلوده نشده است. ممکن است تست خیلی زود انجام گرفته باشد که در این صورت تست ۳ ماه بعد تکرار شود.
- در افراد مسن بالاي ۵۵ سال هم ممکن است منفی کاذب رخ دهد چون DTH درطول زمان کاهش می یابد. اما اگر چند ماه بعد تست دوباره انجام گیرد بدلیل فعالیت مجدد ایمنی سلولی تست مثبت می گردد. بنابراین توصیه می گردد درافراد مسن مشکوك تست در دو مرحله انجام گیرد.
