رشد باکتری ها مسیر های مختلفی دارد و هر باکتری باتوجه به ویژگی هایش نیاز های تغذیه ای و مسیر های رشد متفاوتی دارد. در آزمایشگاه رشد باکتری ها یک وسیله تشخیصی به شمار میرود و با تهیه محیط های انحصاری میتوان هر نمونه را نسبت به وجود گونه ای خاص از باکتری ها بررسی کرد. کشت یت Cultivation به تهیه شرایط محیطی مناسب براي فراینـد رشد و تکثیـر ارگانیسـم هـا گفته میشود. میکروارگانیسـم هـاي درحال رشد، تکثیر دارند بنابراین به عناصري که در ساختمان شیمیایی شان وجود دارد نیازمندند و این مواد مغذي هستند کـه ایـن عناصر را به شکل قابل متابولیزه براي ارگانیسم فراهم می کند. عوامل فیزیکی و شیمیایی مؤثر در رشد باکتری ها عبارتند از عوامـل تغذیـه اي (مـواد مغـذي) و محیطـی (pH، دما، اکسـیژن، نمک و قدرت یونی) می توانند رشد باکتري ها را تحت تاثیر قرار دهند. سرفصل هایی که در این مطلب مطالعه خواهیم کرد عبارتند از:
- انواع تغذیه در رشد باکتری ها
- عوامل غیر تغذیه ای
- تکثیر باکتری ها
- منحنی رشد باکتری ها
بیشتر بخوانید: طبقه بندی باکتری ها
انواع تغذیه در رشد باکتری ها
همانطور که گفتیم هر باکتری با توجه به عوامل رشدی که دارد نیاز به عوامل تغذیه ای متفاوتی دارد. به طور کلی اغلب باکتری ها را با توجه به نوع تغذیه میتوان در سه گروه اتو تروف، هترو تروف و کموتروف جای داد.
اتوتروف ها از CO2 به عنوان منبع کربن استفاده می کنند. آنها قادرند همانند گیاهان از انرژي فتوسنتز براي احیاء CO2 به هزینـه اکسید شدن آب استفاده کرده و به مواد مغـذي آلـی بـراي رشـد احتیـاج ندارنـد. آنهـا بـراي رشـد بـه آب، CO2 و مـواد معـدنی نیازمندند.
هتروتروف ها به کربن آلی قابل جذب براي رشد خود احتیاج دارند. مثلاً گلوکز به عنـوان منبـع کـربن مـی توانـد رشـد تعـداد زیادي از ارگانیسم ها را تأمین کند. هر گونه اي از باکتري ها ممکن است به منبع کربن خـاص خـود احتیـاج داشـته با شـد و یـک سوبسترا ممکن است براي یک باکتري عامل رشد و براي باکتري دیگر مهارکننده باشد.
در رشد باکتری های کموتروف، منبع تامین انرژی مواد شیمیایی هستند. ای باکتری ها دو نوعند:
- کمولیتوتروف: باکتری هایی هستند که مواد آلی را به عنوان منبع الکترون استفاده میکنند. برای مثال باکتری نیتروزوموناس از آمونیوم استفاده میکند و نیتریت تولید میکند.
- کموارگانوتروف: بسیاری از باکتری ها ازجمله باکتری های بیماری زا، مواد آلی مانند قند ها و اسید های چرب را به عنوان دهنده الکترون استفاده میکنند. مانند باکتری سودوموناس سودوفلاوا.
لازم به ذکر است که بسیاری از باکتری محدود به یک شیوه نیستند و ممکن است از شیوه های مختلفی که در بالا ذکر شد به طور ترکیبی استفاده کنند. در زیر میتوانید دسته بندی تغذیه ای باکتری ها را به طور خلاصه ببینید:
نیتروژن
تمام میکروارگانیسم هابـه نیتـروژن احتیـاج دارنـد. رشد باکتری ها نیز مستثنی نیست. نیتـروژن یـک جـزء عمـده سـاختار پـروتئین هـا و اسـیدهاي نوکلئیک است و حدود ۵درصد از وزن خشک یک باکتري را شامل می شود. مولکـول N2 کـه ۸۰% جـو کـره زمـین را تشـکیل مـی دهد بسیار پایدار است و انرژي زیادي براي شکستن پیوند N≡N نیاز است. توانایی جذب و احیاء مولکول هـاي N2 بـه آمونیـاك را ” تثبیت نیتروژن” (Fixation Nitrogen) گویند که براي ادامه حیات کـره زمـین ضـروري اسـت و از ویژگـی منحصـر به فـرد پروکاریوت ها است و توسط تعداد بسیار محـدودي از بـاکتري هـا انجـام مـی گیـرد. همچنـین تثبیـت ازت مـی توانـد بـه شـکل همزیستی باکتري هاي گروه ریزوبیاسه با ریشه برخی از گیاهان باشد.
فراورده نهایی تمام مسـیرهاي جـذب و اسـتفاده از نیتـروژن شکل کاملاً احیا شده این عنصر یعنی آمونیاك (NH3) می باشد. وقتی آمونیاك در محیط موجود باشـد بـه شـکل گـازمحلول از طریق کانال هاي غشایی وارد سلول اکثر باکتري ها می شود و نیازي به تبـدیل بـه یـون آمونیـوم نـدارد. اکثـر میکروارگانیسـم هـا قادرند از آمونیاك به عنوان تنها منبع نیتروژن استفاده کنند و برخـی هـم قادرنـد از آمـین هـا (R-NH2) یـا اسـیدهاي آمینـه یـون +NH4 تولیـد کننــد. تولیــد آمونیـوم بــا آمــین بــرداري از اسـیدهاي آمینــه را “آمونیفیکاســیون” (Ammonification) گوینــد.
آمونیاك به وسیله روندهاي بیوشیمیایی داراي اسید هاي آمینه گلوتامات و گلوتامین به ساختمان مواد آلـی وارد مـی شـود. تعـداد زیادي از ارگانیسم ها هم قادرند نیترات (-NO3) و نیتریت (-NO2) را به آمونیـوم تبـدیل کنند کـه ایـن فراینـد را احیـا ء نیتـرات و نیتریت گویند. برخی باکتري هاي اتوتروف (مثل نیتروزوموناس و نیتروباکتر) قادرند در شرایط بی هـوازي آمونیـاك را بـه گـاز N2 تبدیل کنند این فرایند را “شوره برداري یا نیترات زدایی” (denitrification) گویند.
گوگرد وفسفر در رشد باکتری ها
گوگرد به عنوان بخشی از ساختمان چندین کو آنزیم و در گروه هـاي سیسـتئین و متیـونین پـروتئین هـا یافـت مـی شود. گوگرد به شکل عنصري براي گیاهان و جانوران قابل استفاده نیست. اکثر میکروارگانیسم ها از “سولفات” به عنوان گـوگرد استفاده می کنند و سولفات را به H2S احیاء می کنند. همچنین گوگرد موجود در اسیدهاي آمینه می تواند توسـط فعالیـت آنـزیم سیستئین دسولفوراز باکتري هاي هتروترف آزاد و مورد استفاده قرار گیرد.
فسفات ها(۳-PO4)، به عنوان جزئی از ATP ،اسیدهاي نوکلئیک، اجزاء دیواره سـلولی، فسـفولیپیدها، لیپیـد A و غیره به کار می رود. فسفات همیشه به شکل فسفات غیرآلی (Pi) جذب ارگانیسم می شود.
آهن
آهن به عنوان قسمتی از کوآنزیم هاي ستیوکروم ها و پراکسیدازها یک ماده ضروري براي رشد اکثر باکتري و محلول اما در شرایط هوازي به شکل Fe2+ هاست. در شرایط بی هوازي عموماً آهن به حالت Fe+3 و غیر محلول است. دربدن انسان اساساً آهن آزاد نداریم بلکه در درون مجموعه اي متشکل از پروتئین هایی همچون ترانسفرین و لاکتوفرین قرار دارد. آهن در رشد باکتری ها نیز نقش دارد. باکتري ها با ترشح سیدروفورها باعث جذب ۳+FE و انتقال آن به صورت یک ترکیب محلول می شوند. سیدروفورها بر اساس لیگاند جذب کننده یون آهن به دو دسته تقسیم می شوند: هیدروکسامات ها که سیدرآمین نیز نامیده می شوند و مشتقات کاتکول (مانند ۲و۳ -دي هیدروکسی بنزوئیل سرین). مجموعه آهن- سیدروفور باکمک پروتئین های خاصی در غشاء خارجی شناسایی شده و از طریق پروتئین هاي وابسته به TonB به فضاي پري پلاسمیک وارد می کمپلکس Fe+3 به سیدروفور Fe+2 احیاء شده و آهن آزاد می گردد، سیدروفور نیز از سلول خارج و یا در مواردي تجزیه می شود.
عوامل غیر تغذیه ای موثر بر رشد باکتری ها
ترکیبی که سلول قادر به تولید آن نیست و باید براي رشد سلول وجود داشـته باشـد عامل رشد نامیده میشود. هـر ترکیـب ضـروري بـراي رشـد و یـا تکثیر سلول از طریق یکسري واکنش هاي آنزیمی تولید می شود هرگاه در ارگانیسمی جهشـی رخ دهـد کـه بـه فقـدان عملکـرد یکی از این آنزیم ها منجر گردد و فراورده هایی تولید نشود این ارگانیسـم مجبـور اسـت ترکیـب مـورد نظـر را از محـیط کشـت دریافت کند و باید به محیط آن اضافه گردد. آن ترکیب براي ارگانیسم عامل رشد محسوب می گـردد و ارگانیسـم مـورد نظـر نسبت به آن ماده اگزوتروف است. برخی باکتري ها مثل لاکتوباسیل ها توانایی سنتز ۴۰-۳۰ ماده را از دست داده اند.
PH در رشد باکتری ها
براساس توانایی رشد باکتری ها در pH هاي مختلف، آن ها را به سه گروه تقسیم می کنند:
- نوترالوفیل ها: این باکتري ها بهترین شرایط رشد را در pH 8-6 دارند
- اسیدوفیل ها: باکتري هایی هستند که در pH هاي پائین (۶/۵ – ۱) رشد می کنند اما بهترین pH حدود ۳ است
- آلکالوفیل ها: باکتري هایی هستند که در pH هاي بالا(۱۱-۹) رشد می کنند اما بهترین pH حدود ۱۰/۵ است
میکروارگانیسم ها، pH داخلی خود را در محدوده وسیعی از pH خارج سلولی تنظیم می کنند به طوریکه اسیدوفیل هـا pH خـود را در محدوده ۶/۵، نوترالوفیل هادر ۷/۵ وآلکالوفیل ها در ۹/۵ نگـه مـی دارنـد. pH داخلـی برای رشد بـاکتری ها از طریـق مجموعـه ای از سیستم هاي انتقال پروتون در غشاء سلولی شامل یک پمپ وابسته به ATP و یک تعویض کننده یون سدیم با پروتـون تنظـیم می شود. تغییرات pH محیط هاي کشت را می توان با اضافه کردن بافر ها تا حد زیادي جلوگیري نمود.
دما
براساس رشد باکتری ها در شرایط بهینه در دماهاي مختلف باکتري ها به چهار دسته تقسیم می شوند:
- سرما دوست (Psychrophilic): در دماي حدود کمتر از ۲۰ درجه سانتی گراد قابلیت رشد دارنـد ولـی شـرایط بهینـه بـراي بسیاري از آنها حدود ۴ درجه است. باکتري هایی که در یخچال قادر به رشدند در این دسته قرار می گیرند. برخـی از گونـه هـاي باکتري هاي بیماریزایی مثل لیستریا و یرسینیا قابلیت رشـد در دمـاي یخچـال را دارنـد ایـن میکروارگانسـیم هـا اساسـاً در عمـق اقیانوس ها و برخی نواحی منجمد شمالی وجود دارند.
- مزوفیلیک (Mesophilic): در دمایی حدود ۴۵-۳۰ درجه سانتی گراد رشد می کنند (باکتري هاي بیماري زا)
- گرما دوست (Thermophilic): در دماي حدود ۶۵-۵۰ درجه سانتی گراد رشد می کنند.
- هایپرترموفیلیک (Hyperthermophilic): در دماهاي بالاي ۷۰ درجه و حتی نقطه جوش رشد می کند. این باکتري ها در چشمه هاي آب گرم که دما بالاست زندگی می کنند.
بیشتر بخوانید:یرسینیا پستیس، لیستریا مونوسیتوژنز
اکسیژن در رشد باکتری ها
براساس نیاز رشد باکتری ها به O2 باکتري ها به چند دسته تقسیم بندي می شوند:
- هوازي اجباري: از اکسیژن به عنوان گیرنده الکترون (پذیرنده H) استفاده می کنند و تنها در مجاورت O2 رشد می کنند.
- بی هوازي اجباري (مطلق) (anaerobe Strict, Obligate): در تماس با اکسیژن کشـته مـی شـوند و در یـک اتمسـفر فاقـد اکسیژن رشد می کنند.
- بی هوازي اختیاري (anaerobe Facultaitive): در شرایط هوازي و بی هوازي هر دو توانایی رشد دارند.
- بی هوازیهاي تحمل کننده هوا (anaerobe aerotolerant): در شرایط بی هوازي رشد می کنند اما در تماس با هوا سـریعاً کشته نمی شوند.
- میکروآئروفیل ها (Microaerophilic): درفشارهاي پائین اکسـیژن (۷-۵%) و حضـور CO2 بیشـترین رشـد را دارنـد امـا در مجاورت فشارهاي بالاي اکسیژن رشد آنها مهار می شوند.
- کاپنوفیل ها: این باکتري ها براي رشد بهینه علاوه بر اکسیژن نیاز به ۱۰-۵% CO2 نیز دارند.
باکتري هاي بی هوازي هاي اجباري و تحمل کننده هاي هوا، متابولیسم کاملاً تخمیري دارنـد؛ امـا بـی هـوازي هـاي اختیـاري در حضور اکسیژن از روش تنفس و در فقدان اکسیژن از روش تخمیر استفاده می کنند. فراورده هاي متابولیسم هوازي، ترکیبات فعالی مانند H2O2 و یون سوپراکسید می باشند. ایندو ترکیـب در حضـور آهـن بنیان هاي فعال هیدروکسیل OH تولید می کنند که واکنش گرند و به ماکرومولکول هاي حیـاتی از جملـه DNA آسـیب مـی رسانند. باکتري هاي هوازي و برخی از بی هوازي ها داراي آنزیم سوپراکسید دیس موتاز اندکه آن هـا را در برابـر ایـن بنیان ها محافظت می کند.
تمام بی هوازي هاي اجباري فاقد SOD و کاتالازند. در رشد بـاکتري هـاي بـی هـوازي، برخی از آن ها مثـل پپتوکوکـوس انئروبیـوس داراي تحمل قابل توجهی به اکسیژن هستند و قادرند مقادیر زیادي آنزیم NADH اکسیداز تولید و اکسیژن را به آب تبدیل کنند. H2O2 بدلیل خاصیت اکسید کنندگی قوي، باعث آسیب به DNA می شود. بنابراین موتانت هـاي فاقـد سیسـتم تـرمیم بـه اثـرات پراکسید هیدروژن حساسند. دیده شـده کـه محصـول ژن recA کـه در نـوترکیبی و تـرمیم ژن هـا نقـش دارد بیشـتر از کاتـالاز و SOD در محافظت اشرشیا کولی در برابر اثرات سمی آب اکسیژنه دخالت دارد.
فشار اسمزي و قدرت یونی
براي اکثر باکتري ها، ویژگی هاي محیط کشت معمولی از نظر فشار اسمزي و غلظـت نمـک هـا بـراي رشـد کافیست امـا بـراي گونه هاي آبزي یا آن هایی که در محلول هاي غلیظ قندي یا نمکی زندگی می کند باید عوامل فوق رعایت شوند. بـاکتري هـایی که براي رشد خود به غلظـت هـاي بـالاي نمـک نیـاز دارنـد، هالوفیـل و آن هـایی کـه در فشـار اسـمزي بـالایی رشـد مـی کننـد اسموفیل گویند.
تکثیر باکتری ها
در میکروب شناسی رشد باکتری همان تکثیر باکتری است زیرا باکتری ها نیز مانند سایر موجودات تک سلولی پس از مدتی تغذیه افزایش حجم پیدا می کنند ولی چون فاصله بین افزایش حجم و تقسیم شدن آنها تقریباً ثابت است بنابراین رشد باکتری می تواند تکثیر آن نیز باشد. رایج ترین روش تکثیر در باکتری ها تقسیم دوتایی (Binarry fission) میباشد که در این نوع تقسیم سلول تولید دو سلول مینماید. این امر در باسیل ها بهتر مشاهده می شود. مراحل آن بدین ترتیب است که ابتدا حجم سلول باکتری اضافه می شود به طوری که دیواره سلولی قادر به تحمل این حجم نیست (از اختصاصات ارثی باکتری است) سپس مواد ژنتیکی باکتری دو برابر می شود و پرده سیتوپلاسمی رشد می کند و دیواره سلولی فرورفتگی می یابد و بالاخره سیتوپلاسم باکتری تقسیم میشود و باکتری به دو نیم می گردد تبدیل یک سلول به دو سلول و دو سلول به چهار سلول در واقع تصاعد لگاریتمی است.
زمان تزاید مدت زمانی است که تعداد باکتری ها ی یک مجموعه دو برابر می شود. به عبارت دیگر مدت زمانی است که یک باکتری به دو باکتری تقسیم می شود. اکثر باکتریها دارای زمان تزاید ۳-۱ ساعت میباشند. اشرشیا کلی هر ۲۰ دقیقه، دو برابر می شود. اکثر باکتری های بیماریزا زمان تزاید کمتر از یک ساعت دارند. تعداد محدودی از باکتری های بیماریزا دارای زمان های تزاید طولانی میباشند به طور مثال ترپونما پالیدوم عامل بیماری سیفیلیس دارای زمان تزاید ۳۰ ساعت و مایکوباکتریوم توبرکلوزیس عامل بیماری سل در محیط کشت زمان تزاید حدود ۱۴-۱۳ ساعت و مایکوباکتریوم لپره عامل بیماری جذام زمان تزاید ۱۳ روز دارد البته مایکوباکتریوم لپره در محیط های کشت مصنوعی کشت نمی شود.
منحنی رشد باکتری ها
در صورتیکه که باکتري هاي یک کشت تازه به محیط کشت مایع جدید تلقیح شود و تعداد سلول هـاي زنـده در هـر میلـی لیتـر در فواصل زمانی معین اندازه گیري شود منحنی های زیر بدست می آید:
مرحله تأخیري یا Lag phase
مرحله ایست که سلول بدلیل قرار داشتن در شرایط محیطی نامناسب قبلی از متابولیت ها و آنزیم ها تخلیه شده و در حـال سـاختن مواد مورد نیاز براي سازش با محیط جدید است. اگر محیط کشت قبل کاملاً متفاوت باشد این مرحلـه طـولانی تـر اسـت. در ایـن مرحله معمولاً باکتري تکثیر نمی یابند و تعداد سـلول هـا افـزایش نشـان نمـی دهـد ولـی حجمشـان افـزایش دارد. میـزان RNA و پروتئین هاي سلول افزایش نشان می دهند و سلول خود را براي ورود به مرحله جدیدي از رشد آماده می کند.
مرحله رشد تصاعدي یا لگاریتمی
دراین مرحله از رشد باکتري ها با سرعت ثابتی تقسیم می شوند که به ماهیت میکروارگانیسم و شـرایط محـیط بسـتگی دارد. بـاکتري هـا در وضعیتی متعادل به سر می برند ومواد سلولی جدید با سرعت ثابتی تولید می شوند و توده سـلولی بـه شکل تصـاعدي افـزایش می یابد. زمان تزاید به حداقل می رسد ولی میزان رشد (تعداد تقسیمات در ساعت) ثابت است. در این مرحلـه بسـیاري از گیرنـده های غذایی و دارویی فعال اند و باکتري ها می توانند حساسیت و یا مقاومت واقعی خود را نشان دهند. این روند رشـد فزاینـده تـا زمانی ادامه پیدا می کند که یا مواد زاید و سمی درمحیط کشت افزایش یابند و یـا یـک یـا چنـد مـاده غـذایی ضـر وري بـه اتمـام برسد. در هوازي ها عامل محدود کننده رشد می تواند کاهش اکسیژن باشد.
مرحله ثابت یا ایستایی یا phase Stationary
در نهایت در این مرحله بدلیل اتمام مواد غذایی و تجمع مواد سمی، تغییرات pH و کاهش اکسیژن رشد باکتري متوقف می شـود و با این وجود تولید و جایگزینی سلول ها وجود دارد درواقع تعداد موارد مرگ و تولیـد سـلول هـا در حـال تعـادل اسـت و لـذا تعداد سلول هاي زنده ثابت باقی می ماند و در برخی مواقع سلول ها تغییر شکل و رشد نامتعادل بـاکتري هـا را داریـم. بسـیاري از گیرنده هاي سطحی بدلیل مواد زائد سمی بسته شده و آنتی بیوتیک هایی که در مرحله رشد اثر داشـته انـد موفقیـت آمیـز نیسـتند. معمولاً رشد باکتری ها بر روي پلیت هاي آگار در این فاز قرار می گیرند و در این مرحله است که باکتري ها تولید اسپورمی کنند.
مرحله مرگ یا Decline phase
پس از مرحله ایستایی رشد باکتری ها سرعت مرگ افزایش می یابد تا اینکه به یک سرعت ثابتی برسد. پس از مرگ اکثریت سـلول هـا، سـرعت مرگ به طور بارزي کاهش می یابد به طوري که تعداد کمی از سلول ها براي ماه ها باقی می ماننـد. تعـداد کمـی از سـلول هـا بـه کمک مواد مغذي حاصل از مرگ سلول هاي مرده رشد می کنند.
